Para ser aspirante había que presentar fe de bautismo y una declaración certificada por un notario en la que constara que se había cumplido con un periodo de cinco años como ayudante de un cirujano autorizado. También se necesitaban pruebas documentales de la legitimidad de su nacimiento, de la legalidad del matrimonio de sus padres, de la pureza de su sangre (que sus antepasados fueran únicamente cristianos españoles) y de no tener problemas con la Inquisición.

Además de examinar a médicos y cirujanos, el Tribunal regulaba a boticarios, barberos, flebotomianos, dentistas, algebristas, hernistas y parteras e imponía castigos por ejercer la medicina sin autorización. También eran parte de sus funciones aprobar textos para la enseñanza de la medicina y la cirugía; imprimir cartillas a sangradores y parteras; establecer cuarentenas en poblaciones afectadas por epidemias; vigilar el buen estado de conservación de alimentos y bebidas puestas al consumo público, y velar por la salubridad y limpieza de las calles.

El Archivo General de la Nación resguarda en el Fondo Protomedicato la documentación que el Tribunal generó entre 1726 y 1816. Dicha institución fue suprimida en 1831 y sus funciones quedaron bajo la responsabilidad de la Junta de la Facultad Médica del Distrito Federal.