De acuerdo al Estatuto Provisional del Imperio, en ausencia del emperador, la emperatriz debía fungir como regente de México. En los periodos en los que Maximiliano se encontraba realizando viajes al interior del país, Carlota se caracterizó por tener una actitud decisiva que derivó en una actividad política constante e importante, convirtiéndose en la primera mujer gobernante en el país. En materia laboral, promulgó la abolición de los castigos corporales y estableció un límite para las jornadas de trabajo; en lo social estuvo comprometida con las causas de personas vulnerables destinando importantes sumas de dinero para obras de caridad, guarderías, asilos y orfanatos; y en cuanto a asuntos relacionados con la educación, fundó un conservatorio y una academia de artes y promulgó la Ley de Instrucción Pública para garantizar que la educación primaria fuera obligatoria y gratuita. 

La pérdida de apoyo por parte de los conservadores ante las políticas liberales adoptadas por la pareja imperial, la salida del ejército francés de territorio mexicano y el rechazo de los simpatizantes del gobierno de Juárez obligaron a Carlota a emprender un viaje a Europa para solicitar ayuda de la nobleza, sin éxito, para posteriormente entrevistarse con el papa Pío IX, quien tampoco atendió a sus súplicas. Estando en la Santa Sede comenzó a mostrar síntomas de desequilibrio mental, que se agravaron ante la noticia del fusilamiento de Maximiliano. Carlota pasó el resto de su vida recluida, primero en el Castillo de Miramar, luego en el de Tervuren y, finalmente, en el de Bouchout, donde murió el 19 de enero de 1927.